Wikipedie

3DISCO

histologická metoda

3DISCO (zkratka z anglického "3D imaging of solvent-cleared organs", volně přeloženo 3D zobrazování orgánů zprůhledněných organickými rozpouštědly)[1] je histologická metoda pomocí níž lze zprůhlednit biologické vzorky jako biopsie tkání či celé orgány. Využívají se k tomu organická rozpouštědla, která zajistí co největší podobnost indexů lomu vzorku a okolního média. Transparentní vzorky poté lze zobrazovat celé najednou pomocí fluorescenční mikroskopie, bez nutnosti časově náročného a pracného fyzického řezání a následné rekonstrukce 3D obrazové informace z těchto řezů.

Metoda byla původně vyvinuta pro zprůhlednění a zobrazování spinální míchy a mozku myší a pro výzkum v oblasti neurobiologie.[1][2] Postupně však byla úspěšně modifikována a využita pro analýzu mnoha různých vzorků z více oblastí biologického výzkumu: celých myších těl,[3] kmenových buněk,[4][5] nádorové tkáně[6][7][8] a v neposlední řadě ke zkoumání vývojových procesů u modelových organismů[9][10] či lidských embryí.[11]

Historie a vznik metody editovat

Využití organických rozpouštědel pro zprůhlednění tkání bylo poprvé popsáno již před sto lety německým anatomem Wernerem Spalteholzem.[12] Kromě několika málo publikací[12][13][14] však zůstala metoda na okraji zájmu po celé dvacáté století. Až v posledních dvou dekádách došlo k renesanci metod pro zprůhlednění tkání, zejména díky rychlému pokroku na poli nových mikroskopických technik, které umožňují trojrozměrné zobrazování objemných vzorků (konfokální, multifotonová či light sheet mikroskopie).[14][15]

Autoři první novodobé techniky pro zprůhledňování tkání využili směsi organických rozpouštědel benzyl alkoholu a benzyl benzoátu (BABB) ke zprůhlednění myšího mozku a celého těla D. melanogaster.[16] Tento roztok však poškozoval fluorescenční signál z GFP (zelený fluorescenční protein z anglického "green fluorescent protein") a navíc pomocí něho nebylo možné zprůhlednit výrazně myelinizované tkáně z dospělých jedinců.[1] Tyto nevýhody vedly další autory k snaze najít vhodnější rozpouštědla, která by zachovávala signál z fluorescenčních proteinů a pomocí nichž by bylo možné dosáhnout efektivnějšího zprůhlednění vzorků. Z testovaných látek se jako nejlepší ukázaly tetrahydrofuran (THF) a dibenzyl ether (DBE).[17] Na základě těchto poznatků byl v roce 2012 publikován 3DISCO protokol pro projasňování tkáni.[1]

3DSICO protokol editovat

3DISCO protokol se skládá ze tří hlavních kroků:

  1. dehydratace tkáně pomocí THF
  2. extrakce lipidů inkubací v dichlormethanu (DCM)
  3. sjednocení indexů lomu ponořením vzorku do DBE

Princip protokolu editovat

Biologické vzorky (tkáně) jsou heterogenní struktury tvořené mnoha složkami (voda, lipidy, proteiny) s rozdílnými chemickými a fyzikálními vlastnostmi. Například voda má index lomu 1,33 zatímco lipidy a proteiny mají index lomu okolo 1,4 - 1,45.[18] Výsledkem těchto rozdílů v indexech lomu jednotlivých složek tkáně je rozptyl světla procházejícího vzorkem a ztráta rozlišení či signálu při pozorování vzorků silnějších než několik desítek mikrometrů. Postupná dehydratace a delipidace tkáně, následovaná zobrazováním v médiu s indexem lomu blízkým zobrazovaným strukturám, vede ke snížení rozptylu světla a ve výsledku ke zprůhlednění vzorku.[19][20]

Celý protokol pak vypadá následovně: po fixaci tkáně a jejím případném barvení, je vzorek dehydratován inkubací v čím dál koncentrovanějších roztocích THF ve vodě (50%, 70%, 80% a 100%). Díky absenci alkoholových, aldehydových či ketonových skupin je THF méně reaktivní a zachovává fluorescenci lépe než jiná dehydratační činidla.[17][20] Po dehydrataci je vzorek ponořen nejdříve do DCM a poté do DBE pro co nejlepší sjednocení indexů lomu zobrazované tkáně a okolního média, tak aby docházelo k co nejmenšímu rozptylu světla. V DBE jsou vzorky posléze zobrazovány a případně v něm mohou být i skladovány.[1]

Značení editovat

3DISCO protokol byl původně vyvinutý a je nejvhodnější pro pozorování fixovaných vzorků značených co nejsilnějšími fluorofory, ideálně z transgenních modelových organismů exprimujících GFP.[20] Pro vzorky barvené fluorescenčně značenými protilátkami byl protokol optimalizovaný a publikovaný pod názvem iDISCO (viz kapitolu Modifikace a využití).[10]

Výhody a nedostatky metody editovat

Celý protokol je relativně jednoduchý na provedení, v podstatě vyžaduje jen výměnu jednotlivých roztoků a vybavení běžně dostupné v biologické laboratoři. Celý proces od fixace vzorku po jeho zobrazení zabere jen několik desítek hodin. To je relativně krátká doba, obzvlášť ve srovnání s alternativou v podobě fyzického řezání vzorku, barvení jednotlivých řezů a jejich následného zobrazování což může zabrat i týdny při analýze stejně objemné tkáně.[1][20] 3DISCO je navíc možné použít na různé tipy tkání a orgánů (plíce, slezina, lymfatické uzliny, mozek, mléčné žlázy či nádorovou tkáň).[1][10]

Největšími nedostatky 3DISCO jsou delipidace tkáně během zprůhledňování a tím daná nekompatibilita s lipofilními barvivy, zmenšení tkáně během zprůhledňování,[20] částečná degradace fluorescence,[21] a agresivita použitých chemikálií (jejich toxicita a schopnost poškozovat optiku mikroskopů).[22]

Modifikace a využití editovat

Následující kapitola obsahuje vybrané příklady ilustrující vývoj metod pro zprůhledňovaní tkání založených na organických rozpouštědlech. Neposkytuje vyčerpávající přehled všech publikovaných modifikací a použití.

Modifikace editovat

Díky své univerzalitě byla 3DSICO metoda velmi brzy implementována i dalšími laboratořemi, v kombinaci s různými metodickými přístupy k barvení tkáně (retrográdní značení,[23][24] či značení protilátkami - iDISCO[10]) či při aplikaci na specifické vzorky (celé modelové organismy - uDISCO,[3] specificky fixované vzorky lidské tkáně - DIPCO[8]).

iDISCO (z anglického “immunolabeling-enabled imaging of solvent-cleared organs“, volně přeloženo zobrazování orgánů zprůhledněných organickými rozpouštědly umožňující barvení protilátkami) je modifikace metodiky zahrnující inkubaci tkáně v metanolu, peroxidu vodíku, detergentech a dimetylsulfoxidu ještě před samotným barvením protilátkami a zprůhledňováním. Tato příprava tkáně jednak snižuje autofluorescenci vzorku a zlepšuje poměr signálu k šumu a navíc zlepšuje prostupnost tkáně pro protilátky. Díky tomu je možné obarvit protilátkami a následně projasnit a analyzovat vzorky jako celá myší embrya či celé orgány.[10]

uDISCO (z anglického “ultimate imaging of solvent-cleared organs“, volně přeloženo ultimativní zobrazování orgánů zprůhledněných organickými rozpouštědly) je metoda ve které autoři využili jedné ze zdánlivých nevýhod původního protokolu – zmenšení tkání během projasňování. Použitím terc-butanolu místo THF tento efekt ještě zesílili, díky čemuž pak mohli pozorovat ještě objemnější vzorky (které se zmenšily během projasňování) až do velikosti dospělých jedinců myší.[3]

DIPCO (z anglického "diagnosing immunolabelled paraffin-embedded cleared organs”, volně přeloženo diagnostika imunoznačených zprůhledněných orgánů skladovaných v parafínu) metodika kombinuje deparafinizaci formalinem fixovaných a v parafínu uskladněných vzorků (FFPE z anglického "formalin-fixed parafin-embeded") nádorové tkáně a jejich značení a zprůhlednění podle iDISCO protokolu. FFPE vzorky nádorové tkáně jsou skladované v biobankách po celém světě a široce využívané k diagnostice. Jejich komplexní analýza může pomoct zlepšit stratifikaci pacientů s nádorovým onemocněním.[8]

Využití editovat

Metody pro zprůhlednění tkáně, včetně 3DISCO, byly původně vyvíjeny hlavně vědci zaměřujícími se na neurobiologii. Vzhledem ke strukturní i funkční komplexitě nervového systému je jeho výzkum s využitím klasických metod histologie velmi pracný a časově náročný, a možnost mikroskopicky analyzovat velké objemy tkáně je v neurobiologii velmi žádoucí.[20][22] Většina publikovaných prací je tak zaměřená hlavně na studium centrální nervové soustavy (CNS) u myší, které jsou významným modelovým organismem neurobiologie. Sami autoři 3DISCO metodiky ji využili ke studiu regenerace myší CNS po zranění: mapování trajektorií axonů a kvantifikaci mikroglií a astrocytů.[2] iDISCO modifikace protokolu byla využita ke studiu mozkové aktivity[10] či pro mapování amyloidních plaků, mikroglií a vaskularizace jak u modelových organismů tak u pacientů s Alzheimerovou nemocí.[25]

V posledních letech je kromě studií z oblasti neurobiologie publikováno i množství prací z jiných oborů, využívajících zprůhlednění tkáně organickými rozpouštědly. Příkladem jsou studie věnující se lokalizaci kmenových buněk po transplantaci[3], zobrazování různých vývojových stadií lidských embryí,[11] či diagnostice nádorové tkáně.[8]

Reference editovat

V tomto článku byl použit překlad textu z článku 3DISCO na anglické Wikipedii.

  1. ↑ a b c d e f g ERTÜRK, Ali; BECKER, Klaus; JÄHRLING, Nina. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 2012-10-11, roč. 7, čís. 11, s. 1983–1995. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1754-2189. DOI 10.1038/nprot.2012.119. (En) 
  2. ↑ a b ERTÜRK, Ali; MAUCH, Christoph P; HELLAL, Farida. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 2011-12-25, roč. 18, čís. 1, s. 166–171. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1078-8956. DOI 10.1038/nm.2600. (En) 
  3. ↑ a b c d PAN, Chenchen; CAI, Ruiyao; QUACQUARELLI, Francesca Paola. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 2016-08-22, roč. 13, čís. 10, s. 859–867. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1548-7091. DOI 10.1038/nmeth.3964. (En) 
  4. ↑ ESPINOSA-MEDINA, I.; OUTIN, E.; PICARD, C. A. Parasympathetic ganglia derive from Schwann cell precursors. Science. 2014-07-04, roč. 345, čís. 6192, s. 87–90. PMID 24925912. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0036-8075. DOI 10.1126/science.1253286. PMID 24925912. (anglicky) 
  5. ↑ ACAR, Melih; KOCHERLAKOTA, Kiranmai S.; MURPHY, Malea M. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 2015-09-23, roč. 526, čís. 7571, s. 126–130. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0028-0836. DOI 10.1038/nature15250. PMID 26416744. (En) 
  6. ↑ GAROFALO, Stefano; D’ALESSANDRO, Giuseppina; CHECE, Giuseppina. Enriched environment reduces glioma growth through immune and non-immune mechanisms in mice. Nature Communications. 2015-03-30, roč. 6, čís. 1. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2041-1723. DOI 10.1038/ncomms7623. PMID 25818172. (En) 
  7. ↑ OSHIMORI, Naoki; ORISTIAN, Daniel; FUCHS, Elaine. TGF-β Promotes Heterogeneity and Drug Resistance in Squamous Cell Carcinoma. Cell. 2015-02, roč. 160, čís. 5, s. 963–976. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0092-8674. DOI 10.1016/j.cell.2015.01.043. PMID 25723170. 
  8. ↑ a b c d TANAKA, Nobuyuki; KANATANI, Shigeaki; TOMER, Raju. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 2017-10, roč. 1, čís. 10, s. 796–806. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2157-846X. DOI 10.1038/s41551-017-0139-0. (En) 
  9. ↑ LAFKAS, Daniel; SHELTON, Amy; CHIU, Cecilia. Therapeutic antibodies reveal Notch control of transdifferentiation in the adult lung. Nature. 2015-11-18, roč. 528, čís. 7580. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0028-0836. DOI 10.1038/nature15715. (En) 
  10. ↑ a b c d e f RENIER, Nicolas; WU, Zhuhao; SIMON, David J. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 2014-11, roč. 159, čís. 4, s. 896–910. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0092-8674. DOI 10.1016/j.cell.2014.10.010. 
  11. ↑ a b BELLE, Morgane; GODEFROY, David; COULY, Gérard. Tridimensional Visualization and Analysis of Early Human Development. Cell. 2017-03, roč. 169, čís. 1, s. 161–173.e12. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0092-8674. DOI 10.1016/j.cell.2017.03.008. 
  12. ↑ a b STEINKE, H.; WOLFF, W. A modified Spalteholz technique with preservation of the histology. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 2001-01, roč. 183, čís. 1, s. 91–95. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0940-9602. DOI 10.1016/s0940-9602(01)80020-0. 
  13. ↑ Der Unfallchirurg: gesamte Unfallchirurgie einschliesslich Sporttraumatologie.. Der Unfallchirurg : gesamte Unfallchirurgie einschliesslich Sporttraumatologie.. 1985. OCLC: 884757739. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0177-5537. (German) 
  14. ↑ a b AZARIPOUR, Adriano; LAGERWEIJ, Tonny; SCHARFBILLIG, Christina. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 2016-08, roč. 51, čís. 2, s. 9–23. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0079-6336. DOI 10.1016/j.proghi.2016.04.001. 
  15. ↑ SILVESTRI, Ludovico; COSTANTINI, Irene; SACCONI, Leonardo. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 2016-03-28, roč. 21, čís. 8, s. 081205. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1083-3668. DOI 10.1117/1.jbo.21.8.081205. 
  16. ↑ DODT, Hans-Ulrich; LEISCHNER, Ulrich; SCHIERLOH, Anja. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 2007-03-25, roč. 4, čís. 4, s. 331–336. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1548-7091. DOI 10.1038/nmeth1036. (En) 
  17. ↑ a b BECKER, Klaus; JÄHRLING, Nina; SAGHAFI, Saiedeh. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS ONE. 2012-03-30, roč. 7, čís. 3, s. e33916. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1932-6203. DOI 10.1371/journal.pone.0033916. PMID 22479475. (anglicky) 
  18. ↑ GENINA, Elina A; BASHKATOV, Alexey N; TUCHIN, Valery V. Tissue optical immersion clearing. Expert Review of Medical Devices. 2010-11, roč. 7, čís. 6, s. 825–842. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1743-4440. DOI 10.1586/erd.10.50. (anglicky) 
  19. ↑ RICHARDSON, Douglas S.; LICHTMAN, Jeff W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 2015-07, roč. 162, čís. 2, s. 246–257. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0092-8674. DOI 10.1016/j.cell.2015.06.067. PMID 26186186. 
  20. ↑ a b c d e f ERTÜRK, Ali; BRADKE, Frank. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Experimental Neurology. 2013-04, roč. 242, s. 57–64. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0014-4886. DOI 10.1016/j.expneurol.2012.10.018. 
  21. ↑ HAMA, Hiroshi; HIOKI, Hiroyuki; NAMIKI, Kana. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 2015-09-14, roč. 18, čís. 10, s. 1518–1529. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1097-6256. DOI 10.1038/nn.4107. (En) 
  22. ↑ a b LLOYD-LEWIS, Bethan; DAVIS, Felicity M.; HARRIS, Olivia B. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 2016-12, roč. 18, čís. 1. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 1465-542X. DOI 10.1186/s13058-016-0754-9. PMID 27964754. (En) 
  23. ↑ LAUNAY, Pierre-Serge; GODEFROY, David; KHABOU, Hanen. Combined 3DISCO clearing method, retrograde tracer and ultramicroscopy to map corneal neurons in a whole adult mouse trigeminal ganglion. Experimental Eye Research. 2015-10, roč. 139, s. 136–143. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0014-4835. DOI 10.1016/j.exer.2015.06.008. 
  24. ↑ ŽYGELYTĖ, Emilija; BERNARD, Megan E.; TOMLINSON, Joy E. RetroDISCO: Clearing technique to improve quantification of retrograde labeled motor neurons of intact mouse spinal cords. Journal of Neuroscience Methods. 2016-09, roč. 271, s. 34–42. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 0165-0270. DOI 10.1016/j.jneumeth.2016.05.017. PMID 27268155. 
  25. ↑ LIEBMANN, Thomas; RENIER, Nicolas; BETTAYEB, Karima. Three-Dimensional Study of Alzheimer’s Disease Hallmarks Using the iDISCO Clearing Method. Cell Reports. 2016-07, roč. 16, čís. 4, s. 1138–1152. Dostupné online [cit. 2018-09-24]. ISSN 2211-1247. DOI 10.1016/j.celrep.2016.06.060. PMID 27425620. 
Citováno z „https://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=3DISCO&oldid=21238064“