Western blot: Porovnání verzí
Smazaný obsah Přidaný obsah
Bez shrnutí editace |
Docela jsem přepsal celý článek, přidal jsem více praktický pohled, podrobněji popsal jednotlivé kroky. Chtělo by to nějaké obrázky, možná dodám časem. |
||
Řádek 20:
Pro zviditelnění daného proteinu je nutné použití specifické protilátky proti tomuto proteinu. Existují dva základní principy detekce, buď dvou krokový (kombinace primární protilátky a sekundární protilátky konjugované s reportérovým [[enzym|enzymem]]) či jednokrokový (s reportérovým enzymem je konjugována přímo primární protilátka).
*'''Dvoukroková detekce:'''
Po blokování je membrána přenesena do zředěného roztoku primární protilátky (o koncentraci typicky 0,5 - 5 μg/ml) v pufrovaném roztoku (např. [[TBS|TBS]] či [[PBS|PBS]]) BSA či mléčného kaseinu. Inkubace s primární protilátkou probíhá za mírného míchání, po dobu od 1 hod až přes noc, za laboratorní teploty či při 4 °C.
Po opláchnutí membrány pufrovaným roztokem [[detergent|detergentu]] (např. PBS+ 0,05% Tween 20) je membrána přenesena do roztoku sekundární protilátky - komerčně dodávané protilátky proti celé škále primárních protilátek, nejčastěji jsou to sekundární protilátky proti myším či králičím proteinům (což jsou skoro vždy primární protilátky). Tyto sekundární protilátky vázající primární protilátky jsou konjugovány s nějakým reportérovým enzymem umožňující vizualizaci - např. [[křenová peroxidasa|křenovou peroxidasou]] (HRP, z angl. horseradish peroxidase) či [[alkalická fosfatasa|alkalickou fosfatasou]] (AP, z angl. alcalic phosphatase).
*'''Jednokroková detekce:'''
Při jednokrokové detekci je reportérovým enzymem značena přímo primární protilátka - většinou se tedy jedná o komerčně dodávané primární protilátky proti často používaným proteinům či tagům, např. proti proteinu [[GFP|GFP]], či FLAG-tagu, hemaglutininovému (HA) tagu, His-tagu apod.
Řádek 37:
* '''výhoda:''' oproti detekci proteinů barvením gelu stříbrem je možné poměrně jednoduše, rychle a jednoznačně detekovat jeden protein i ve složité směsi proteinů
* '''nevýhoda:''' nutnost mít primární protilátku proti danému proteinu, jinak je Western blot neproveditelný
== Využití Western blotu ==
Řádek 44 ⟶ 45:
* jako velice užitečná laboratorní metoda v molekulární biologii, biochemii, imunologii a příbuzných oborech
== Použitá literatura ==
| |||