Western blot: Porovnání verzí
Smazaný obsah Přidaný obsah
Bez shrnutí editace značka: editace z Vizuálního editoru |
m přidání obrázků značka: editace z Vizuálního editoru |
||
Řádek 1:
[[Soubor:Anti-lipoic acid immunoblot.png|náhled|320x320pixelů|Výsledek imunoblotu (western blotu) z extraktu prvoka rodu ''Leishmania'', zvýrazněno barvivem citlivým na infračervené světlo. Vpravo je označení molekulové hmotnosti hledaných proteinů v kilodaltonech.]]
'''Western blot''' (v české literatuře též označovaný jako '''imunoblot''') je analytická technika používaná k detekci specifického [[Bílkovina|proteinu]] ve směsi s dalšími proteiny, např. ve vzorku homogenátu [[tkáň|tkáně]] či jiného biologického vzorku. Využívá gelovou [[elektroforéza|elektroforézu]] k separaci proteinů podle jejich velikosti (denaturující [[SDS-PAGE]]), popř. podle jejich celkové trojrozměrné struktury (nativní elektroforéza). Následně jsou proteiny přeneseny („přeblotovány“) z gelu na povrch membrány (nejčastěji [[nitrocelulosa|nitrocelulosové]] či [[PVDF]]), na jejímž povrchu jsou detekovány specifickými [[protilátka]]mi.
Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným [[sérologie|sérologickým metodám]] jako je [[ELISA]], je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale zato přesnější (větší specifičnost).
Metoda dostala své jméno ''Western blot'' jako slovní hříčka na podobnou metodu [[Southern blot]] používanou k detekci [[DNA]] a vyvinutou dříve Edwinem Southernem.
== Metodika Western blotu ==
=== SDS-PAGE ===
Řádek 12 ⟶ 10:
=== Přenos ===
[[Soubor:Western blot wet transfer system Criterion-02.jpg|náhled|320x320pixelů|Zařízení určené k "mokrému" přenosu při western blotu.]]
Gel z elektroforézy se následně přiloží na [[PVDF]] či [[nitrocelulosa|nitrocelulosovou]] membránu a pomocí blotovacího zařízení dojde působením [[elektrický proud|elektrického proudu]] k přenosu proteinů z gelu na povrch membrány. Na membráně vznikne jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu. Přístroj je realizován jako soustava anody (spodní díl) a katody (horní díl). Záporně nabité proteiny (obalené [[SDS]]) jsou elektrickým proudem přeneseny z gelu směrem dolů, tj. na povrch membrány).
Řádek 33 ⟶ 32:
* '''chemiluminiscenční způsob:''' reportérový enzym (peroxidáza) přeměňuje [[chemiluminiscence|chemilumiscenční]] substrát na nestabilní produkt, který se stabilizuje vyzářením kvanta světla. Množství světla je poté úměrné množství peroxidázy, které je přímo úměrné množství daného proteinů. Uvolňované světlo je pak detekováno buď přiložením světlocitlivého filmu, anebo nověji použitím [[Charge-coupled device|CCD]]-kamer. Pro kvantifikaci je opět možné použít [[densitometrie|densitometrii]].
[[Soubor:Western Blot results for HIV test.jpg|náhled|Výsledky western blotu u pacienta testovaného na HIV.|alt=|320x320pixelů]]
== Výhody a nevýhody Western blotu ==
* '''výhoda:''' oproti detekci proteinů barvením gelu stříbrem je možné poměrně jednoduše, rychle a jednoznačně detekovat jeden protein i ve složité směsi proteinů
* '''nevýhoda:''' nutnost mít primární protilátku proti danému proteinu, jinak je Western blot neproveditelný
== Využití Western blotu ==
| |||