Western blot: Porovnání verzí

'''Western Blotblot''' (v české literatuře též označovaný jako '''imunoblot''') je analytická technika používaná k detekci specifického [[Bílkovina|proteinu]] ve směsi s dalšími proteiny, např. ve vzorku homogenátu [[tkáň|tkáně]] či jiného biologického vzorku.

Využívá gelovou [[elektroforéza|elektroforézu]] k separaci proteinů podle jejich velikosti (denaturující [[SDS-PAGE]]), popř. podle jejich celkové trojrozměrné struktury (nativní elektroforéza). Následně jsou proteiny přeneseny ("přeblotovány"„přeblotovány“) z gelu na povrch membrány (nejčastěji [[nitrocelulosa|nitrocelulosové]] či [[PVDF]]), na jejímž povrchu jsou detekovány specifickými [[protilátka]]mi.

Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným [[sérologie|sérologickým metodám]] jako je [[ELISA]], je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale za tozato přesnější (větší specifičnost).

== Metodika Western Blotublotu ==

Povrch membrány je nutné tzv. zablokovat, neboť povrch membrány váže proteiny, tj. jak antigen, tak i následně přidané protilátky. Blokování těchto nespecifických míst se nejčastěji provádí umístěním membrány do zředěného roztoku nějakého levného proteinu - např. 3 - 5 % [[BSA]] či netučné suché mléko v TBS, s přídavkem slabého [[detergent]]u jako je Tween 20 (0,05%). Proteiny BSA či mléčného [[kasein]]u z roztoku se naváží na všechna místa, kam se dosud nenavázaly proteiny při přenosu. Po přidání protilátky se už molekuly [[imunoglobulin]]ů nemohou nespecificky navázat na prázdný povrch membrány, ale musí specificky "hledat"„hledat“ svůj [[epitop]] na přeblotovaných antigenech. Blokováni výrazně snižuje šum pozadí a odstraňuje falešné pozitivity.

Pro zviditelnění daného proteinu je nutné použití specifické protilátky proti tomuto proteinu. Existují dva základní principy detekce, buď dvou krokovýdvoukrokový (kombinace primární protilátky a sekundární protilátky konjugované s reportérovým [[enzym]]em) či jednokrokový (s reportérovým enzymem je konjugována přímo primární protilátka).

Po blokování je membrána přenesena do zředěného roztoku primární protilátky (o koncentraci typicky 0,5 - 5 μg/ml) v pufrovaném roztoku (např. [[TBS]] či [[PBS]]) BSA či mléčného kaseinu. Inkubace s primární protilátkou probíhá za mírného míchání, po dobu od 1 hod. až přes noc, za laboratorní teploty či při 4 °C.

Po opláchnutí membrány pufrovaným roztokem [[detergent]]u (např. PBS+ 0,05% Tween 20) je membrána přenesena do roztoku sekundární protilátky - komerčně dodávané protilátky proti celé škále primárních protilátek, nejčastěji jsou to sekundární protilátky proti myším či králičím proteinům (což jsou skoro vždy primární protilátky). Tyto sekundární protilátky vázající primární protilátky jsou konjugovány s nějakým reportérovým enzymem umožňující vizualizaci - např. [[křenová peroxidasa|křenovou peroxidasou]] (HRP, z angl. horseradish peroxidase) či [[alkalickáAlkalická fosfatasafosfatáza|alkalickou fosfatasoufosfatázou]] (AP, z angl. alcalic phosphatase).

* '''kolorimetrický způsob:''' využívá reakce reportérového enzymu (např. peroxidasyperoxidázy) s chromogenním substrátem. Enzym přeměňuje rozpustný (a bezbarvý) [[substrát]] na nerozpustný a barevný (např. modrý) [[produkt]]. Množství proteinu je poté semikvantitativně stanoveno [[densitometrie|densitometrií]] ("jak„jak moc barevná je daná skvrna"skvrna“).

* '''chemiluminiscenční způsob:''' reportérový enzym (peroxidasaperoxidáza) přeměňuje [[chemiluminiscence|chemilumiscenční]] substrát na nestabilní produkt, který se stabilizuje vyzářením kvanta světla. Množství světla je poté úměrné množství peroxidasyperoxidázy, které je přímo úměrné množství daného proteinů. Uvolňované světlo je pak detekováno buď přiložením světlocitlivého filmu, anebo nověji použitím [[Charge-coupled device|CCD]]-kamer. Pro kvantifikaci je opět možné použít [[densitometrie|densitometrii]].

== Výhody a nevýhody Western Blotublotu ==

* testy na [[HIV]] pozitivitu využívají Western blotu pro zjištění přítomnosti protilátek proti viru HIV v lidském [[sérum|séru]] (sérum testovaného pacienta je použito jako "primární„primární protilátka"protilátka“)