Wikipedie

Fluorescenčně značená protilátka

Fluorescenčně značené protilátky označují konjugát specifické monoklonální protilátky s fluoroforem. Značené protilátky se hojně využívají například v průtokové cytometrii nebo fluorescenční mikroskopii k diagnostickým nebo zobrazovacím účelům.[1] Poprvé byly fluorescenčně značené protilátky popsány v roce 1942 a využity k detekci antigenních determinant v savčí tkáni.[2]

Přímá a nepřímá detekce antigenu na povrchu buňky pomocí primární nebo sekundární fluorescenčně značené protilátky. Fluorofory konjugované s protilátkou mohou být samostatné nebo vázané s menším molekulou (tandemové barvy).
Detekce molekuly na povrchu buňky pomocí fluorescenčně značené protilátky.

Fluorofor je navázán na konstantní část protilátky kovalentní vazbou. Tato vazba se může uskutečnit přes amino, thiolovou nebo hydroxylovou skupinu.[3] Na jednu molekulu protilátky se při konjugační reakci může navázat vyšší počet molekul fluoroforu. Počet fluorescenčních molekul je ale omezený, neboť větší množství fluoroforů by se mohlo navzájem zhášet a tím snižovat intenzitu fluorescence. Konjugační reakce by v ideálním případě neměla mít vliv na aviditu protilátky.[4] Průměrný počet fluorescenčních molekul navázaných na protilátku je definován jako "stupeň značení" (DOL, z angl. degree of labeling) a může být určen na základě absorpčního spektra značené protilátky.[5]

V současné době existuje velké množství fluorescenčních molekul využívaných k vazbě na monoklonální protilátky. Mezi běžně využívané fluorofory patří například fluorescein (FITC), phycoerythrin (PE) nebo allophycocyanin (APC). Pro rozšíření spektra fluorescenčních markerů a pro použití v mnohobarevných analýzách se také využívají tandemové (z angl. tandem dyes) nebo polymerní (z angl. polymer dyes) barvy.[6] Tandemové barvy využívají přenosu energie (FRET) mezi dvěma kovalentně vázanými fluorofory (donorem a akceptorem). Výsledkem je zvýšení rozdílu mezi excitačním a emisním spektrem (Stokesův posuv) tandemové barvy, jejíž emisní spektrum je tak možné odlišit od emisního spektra donorové molekuly.[7] Hojně využívaná tandemová barva je například PE-Cy7 (phycoerythrin kovalentně vázaný s malou molekulou cyanine 7).

Využití v průtokové cytometrii editovat

Průtoková cytometrie a třídění (sorting) buněk je založené na vazbě fluorescenčně značených protilátek na povrchové nebo intracelulární znaky buněk. Specifická vazba epitopu a protilátky zajistí označení vybraných molekulárních znaků specifickým fluoroforem. Na základě rozličné intenzity fluorescence a emisních spekter jednotlivých fluoroforů je pak možné rozlišit a kvantifikovat jednotlivé buněčné populace a případně je třídit.[8]

Využití ve fluorescenční mikroskopii editovat

Ve fluorescenční mikroskopii je využití fluorescenčně značených protilátek označováno jako imunofluorescence. V označení cílové struktury se využívá přímé nebo nepřímé detekce. K zobrazení fluorescenčně označených molekulárních struktur se využívá fluorescenční mikroskop, vybavený speciálními lasery k excitaci fluoroforů a odpovídajícími filtry k detekci emisních spekter.[9]

Přímá a nepřímá detekce editovat

Přímá a nepřímá detekce využívá fluorescenčně značených protilátek v rozdílných stádiích značení. Přímá detekce využívá primární protilátku značenou fluorescenční molekulou pro bezprostřední rozpoznání cílové struktury. Nepřímá detekce využívá značené protilátky až v druhém kroku po označení cílové struktury první neznačenou protilátkou.[10]

Odkazy editovat

Reference editovat

  1. ↑ BIOLABS, Creative. What Are Fluorescent Antibodies? » ADC Review » Creative Biolabs. ADC Review [online]. 2019-07-30 [cit. 2020-07-07]. Dostupné online. (anglicky) 
  2. ↑ IMMUNOLOGISTS, American Association of. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody. The Journal of Immunology. 1942-11-01, roč. 45, čís. 3, s. 159–170. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 0022-1767. (anglicky) 
  3. ↑ SZABÓ, Ágnes; SZENDI-SZATMÁRI, Tímea; UJLAKY-NAGY, László. The Effect of Fluorophore Conjugation on Antibody Affinity and the Photophysical Properties of Dyes. Biophysical Journal. 2018-02-06, roč. 114, čís. 3, s. 688–700. PMID: 29414714 PMCID: PMC5985035. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 0006-3495. DOI 10.1016/j.bpj.2017.12.011. PMID 29414714. 
  4. ↑ VIRA, Shaleen; MEKHEDOV, Elena; HUMPHREY, Glen. Fluorescent labeled antibodies - balancing functionality and degree of labeling. Analytical biochemistry. 2010-07-15, roč. 402, čís. 2, s. 146–150. PMID: 20362543 PMCID: PMC2876214. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 0003-2697. DOI 10.1016/j.ab.2010.03.036. PMID 20362543. 
  5. ↑ GMBH, Abberior. Degree of Labeling (DOI) - Abberior GmbH. www.abberior.com [online]. [cit. 2020-07-07]. Dostupné v archivu pořízeném z originálu dne 2020-07-07. 
  6. ↑ MCKINNON, Katherine M. Flow Cytometry: An Overview. Current protocols in immunology. 2018-02-21, roč. 120, s. 5.1.1–5.1.11. PMID: 29512141 PMCID: PMC5939936. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1934-3671. DOI 10.1002/cpim.40. PMID 29512141. 
  7. ↑ ICCS eNewsletter. www.cytometry.org [online]. [cit. 2020-07-07]. Dostupné v archivu pořízeném dne 2018-09-12. 
  8. ↑ MCKINNON, Katherine M. Flow Cytometry: An Overview. Current protocols in immunology. 2018-02-21, roč. 120, s. 5.1.1–5.1.11. PMID: 29512141 PMCID: PMC5939936. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1934-3671. DOI 10.1002/cpim.40. PMID 29512141. 
  9. ↑ SANDERSON, Michael J.; SMITH, Ian; PARKER, Ian. Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2014-10-01, roč. 2014, čís. 10, s. pdb.top071795. PMID: 25275114 PMCID: PMC4711767. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1940-3402. DOI 10.1101/pdb.top071795. PMID 25275114. 
  10. ↑ OWEN, GETHIN RH.; HÄKKINEN, LARI; WU, CHUANYUE. A Reproducible Technique for Specific Labeling of Antigens Using Preformed Fluorescent Molecular IgG-F(ab’)2 Complexes From Primary Antibodies of the Same Species. Microscopy research and technique. 2010-6, roč. 73, čís. 6, s. 623–630. PMID: 20025053 PMCID: PMC3225404. Dostupné online [cit. 2020-07-07]. ISSN 1059-910X. DOI 10.1002/jemt.20803. PMID 20025053. 
Citováno z „https://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=Fluorescenčně_značená_protilátka&oldid=22438462“